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Ein PCR-Ansatz mit einer DNA-Polymerase, einem pGEX-Primer, den vier

Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP) und vier durch unterschiedliche Fluoreszenzmarker

gekennzeichneten Didesoxyribonukleosidtriphosphaten (ddNTP) wird hergestellt. Der Primer

ist ein 5’- oder ein 3’-Primer. Während der PCR der zu analysierenden Probe wird DNA

polymerisiert. Die Polymerisierung wird beim Einbau eines ddNTP a/jointfilesconvert/377385/bgebrochen, da dann

keine weitere freie 3’-OH-Gruppe mehr vorhanden ist. Es entstehen unterschiedlich lange

DNA-Fragmente. Gleichzeitig wird die DNA-Probe für die Messung amplifiziert.

Die unterschiedlich langen DNA-Fragmente werden nach der PCR mittels

Kapillarelektrophorese im Sequenziergerät aufgetrennt und das jeweilige ddNTP der

Abbruchstelle detektiert. Die Gesamtheit der Daten über die Basen an den Abbruchstellen

ergibt die Basensequenz der DNA.

Ein PCR-Ansatz enthielt:

2 µl BTRRM (Big Dye Terminator Ready Reaction Mix)

2 µl Big Dye Sequencing Buffer (5x)

150-350 ng DNA (gelöst in HPLC-H

1 µl Primer (10 pmol/µl)

HPLC-H

O ad 10 µl

Das PCR-Programm war wie folgt eingestellt:

Segment

Zeit Temperatur Vorgang Anzahl

1 10 s 96°C Denaturierung 1x

10s

4 min

96°C

50°C

60°C

Denaturierung

Annealing

Elongation

30x

unendlich 4°C Konservierung

Für die Kapillarelektrophorese wurden die Proben zunächst von Kontaminationen gereinigt.

Die DNA wurde in 250 µl Ethanol, 90 µl Aqua bidest., 10 µl 3 M Natriumacetat und 2 µl

einer Dextranblau-Lösung (10 µg/µl) für 15 min bei Raumtemperatur gefällt und bei 4°C mit

14000 rpm 20 Minuten lang abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit 250 µl 70 % Ethanol

gewaschen, getrocknet und in 16 µl Aqua bidest. aufgenommen. Eine Verdünnung (4 µl in 16

µl HPLC-H

O) dieser Lösung wurde für die Sequenzierung verwendet.

BTRRM:

A, C, G und T-Dye Terminator Desoxyribonukleosidtriphosphate

1 2 ... 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 ... 93 94

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