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Reaktionsphase. Das Toxin wurde direkt in die Küvette gegeben und der Ansatz durch

Invertieren der Küvette gemischt.

Die Proben wurden mit λ=340 nm angeregt und die Emission bei λ=460 nm über einen

Zeitraum von ca. 4000 s gemessen.

Die verschiedenen Proteine erreichten in der Äquilibrierungsphase unterschiedliche

Absorptionsniveaus. Daher wurde gegebenenfalls die Schlitzweite des

Fluoreszenzspektrometers so verändert, dass die Werte im Messbereich zu liegen kamen.

RhoD, RhoB und RhoG benötigten Schlitzweiten von 9-15 nm, ansonsten wurden

Schlitzweiten von 5-7 nm gewählt.

Als Kontrollen wurden neben der Küvette mit Protein und Toxin jeweils eine Küvette ohne

Protein und eine Küvette ohne Toxin getestet.

Anschließend erfolgte die Auswertung der Graphen. Um den Effekt des Toxins besser

sichtbar zu machen, wurden aus den Originalkurven neue Kurven erstellt, bei denen die

Kurven der Äquilibrierungsphase weggelassen und die Kurven der Reaktionsphase durch eine

Berechnung auf den selben Anfangswert von 500 gebracht wurden:

erhaltener Wert x 500 = neuer Wert

Wert bei Zeitpunkt 0

Zusätzlich wurde die Regression der Absorptionskurven für die ersten 200 Sekunden der

Reaktionsphase berechnet und die Regressionsgeraden graphisch dargestellt.

2.4 Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel

Eine weitere Art die Deamidierung von Rho-Proteinen nachzuweisen ist der Nachweis einer

Änderung des Laufverhaltens der Proteinbanden im SDS-Gel. Der Nachweis beruht darauf,

dass die RhoA-Bande nach der Deamidierung durch CNF1 langsamer wandert als vorher.

Dieses Phänomen wird als Motilitätsänderung („Motilitäts-Shift“) bezeichnet. Auch eine

Transglutaminierung kann durch die Motilitätsänderung nachgewiesen werden. Nach

Transglutaminierung von RhoA wandert die RhoA Bande schneller.

Jeder Ansatz enthielt CNF1

vollständig

und GTPase im Verhältnis 1 : 20

und für einen Ansatz von 20 µl:

2 µl 10x-CNF-Puffer

50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 20 µl.

1 2 ... 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 ... 93 94

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